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组蛋白的新角色:揭示CRISPR-Cas系统的进化和适应性机制

2023-09-15


近日,美国佐治亚大学的Michael P. Terns团队和科罗拉多州立大学Brenton R. Graveley团队在Nature microbiology上发表了一篇关于组蛋白促进CRISPR-Cas系统获取新的抵御外源DNA的间隔序列的文章。

这项研究为理解CRISPR-Cas系统的进化和适应性提供了新的见解,并为该系统在基因编辑和基因组工程中的应用提供了潜在的启示。

在此之前,先为大家简要介绍组蛋白

组蛋白是什么?

组蛋白是构成染色质基本结构的关键蛋白质单元,它们扮演着维持细胞核内秩序和调控基因活性的关键角色。含有遗传信息的DNA与组蛋白相互作用,形成了一种复杂的三维结构,为基因组的稳定性和可调节性提供了基础。

在这个过程中,四种不同的组蛋白通过形成八聚体,将DNA严密地缠绕、包裹在一起,形成染色质纤维。这个高度有序的结构不仅使得基因组能够紧凑地储存在细胞核内,还有助于调控基因的可及性。特定的组蛋白修饰和化学变化,如乙酰化、甲基化和磷酸化,可以影响组蛋白与DNA之间的相互作用,从而在特定的基因区域调节转录的启动或抑制。

这种组蛋白与DNA的紧密互动赋予了组蛋白在细胞生物学中不可或缺的作用。通过改变染色质结构,组蛋白可以影响基因的表达模式,参与细胞分化、发育和应激响应等过程。此外,组蛋白的异常修饰或变化与多种疾病,包括癌症和神经退行性疾病,密切相关。

因此,深入理解组蛋白、染色质结构及其在细胞调控中的功能,对于揭示生命的基本机制以及疾病的发生机理都具有重要的意义。

调控基因表达

研究人员利用组蛋白可以深入了解基因的表达方式。组蛋白的修饰状态可以指示特定基因是否处于激活或抑制状态,从而影响细胞的功能。通过对组蛋白修饰进行分析,科研人员可以揭示出基因调控网络的复杂性,进而深入研究与疾病有关的基因变化。

解码细胞活动

组蛋白在细胞的多个关键活动中发挥着至关重要的作用。通过探究组蛋白在细胞分裂、DNA修复、以及DNA复制等关键过程中的功能,科学家们能够更深入地把握细胞的生命周期,并理解在异常情况下所出现的变化。

组蛋白在药物研发中的应用

组蛋白在药物研发中具有重要地位。其修饰与癌症、神经退行性疾病及炎症等密切相关。研究人员利用组蛋白修饰开发药物,调控基因表达,抑制癌细胞生长、治疗神经疾病和控制炎症反应。表观遗传学药物针对组蛋白修饰,调整基因表达,如DNA甲基转移酶抑制剂应用于白血病治疗。这一领域带来新机会,通过深入了解组蛋白作用机制,开发更有针对性和效力的药物,为疾病治疗带来希望。

回到这篇文章,本文聚焦于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)在细菌和古菌中的间隔获取过程,并探讨其中与组蛋白的关联。CRISPR是免疫系统,能够记录并识别外源DNA序列,并通过RNA介导的酶活性将这些入侵性DNA片段进行剪切。随着时间的推移,这些细菌就能够“记住”之前的入侵,并对其做出更快速、精准的反应。本篇文章研究专注于古菌,旨在揭示组蛋白在CRISPR间隔获取过程中的潜在作用。在模型古菌Pyrococcus furiosus中, Histone A 和Histone B是P. furiosus编码的两种不同但相关的组蛋白。许多古菌都编码两种或更多类似的组蛋白。这两种组蛋白可以形成同源二聚体(A-A, B-B)或异源二聚体(A-B)。

组蛋白二聚体可以包裹大约30个碱基对的DNA,四聚体可以包裹大约60个碱基对。作为主要的蛋白质-DNA结合分子,组蛋白在维持染色质结构、基因表达和DNA可及性方面具有关键作用。研究人员在古菌中的实验中发现,在CRISPR间隔获取位点附近存在特定组蛋白的富集。这个观察引发了研究人员的兴趣,暗示组蛋白可能在古菌的CRISPR间隔获取过程中扮演着重要角色。这一发现有望为深入理解CRISPR系统的功能机制提供新的线索。

为验证这一假设,研究人员采取了以下步骤:

 
  1. 古菌培养和样本准备:首先,选择P. furiosus等古菌模型,进行培养并收集样本,以便后续实验在不同生长阶段和条件下进行。

  2. 染色质免疫共沉淀(ChIP):为确定特定组蛋白在CRISPR间隔获取位点是否富集,研究人员进行ChIP实验。使用抗体沉淀与目标组蛋白结合的DNA片段,定量测量不同基因组区域的组蛋白富集水平。

  3. DNA可及性测定:利用核酸酶测定CRISPR间隔获取位点附近DNA的可及性。通过比较不同条件下的DNA敏感性,评估组蛋白对染色质状态和DNA结构的影响。

  4. 基因组测序和数据分析:ChIP和DNA可及性实验需要基因组测序获得测序数据。研究人员分析这些数据,确定组蛋白在CRISPR间隔获取位点的富集情况和染色质状态变化。

  5. 功能验证实验:证明组蛋白在CRISPR间隔获取中的作用,通过基因敲除或过表达调节组蛋白表达水平,观察CRISPR间隔获取是否受影响。

  6. CRISPR间隔获取实验:引入外源DNA片段并观察CRISPR间隔形成,验证组蛋白作用。在不同组蛋白表达水平条件下进行,确定组蛋白影响程度。

  7. 分子机制研究:进一步实验可能深入研究组蛋白影响CRISPR间隔获取的分子机制。涉及生化实验,如组蛋白与DNA相互作用研究,及其他分子生物学技术。

 

 

图1:MNase保护实验用于表征P. furiosus 的DNA结合蛋白

a、凝胶图像显示通过MNase消化 P. furiosus 染色质产生的DNA片段。彩色框突出显示受保护DNA的主要带。消化实验重复了三次,每次观察到类似的凝胶带模式。b~d、a 中突出显示的DNA带经高通量测序测定,并映射到 P. furiosus 基因组;基因组浏览器轨迹显示了在代表性CRISPR基因座中对齐的读取分布。重叠的条形以颜色编码,表示DNA片段的大小(红色,30±5 bp;金黄色,60±5 bp;绿色,90±5 bp;蓝色,120±5 bp)。y轴表示DNA测序(DNAseq)读取覆盖的累积深度。进行了六次复制实验,并得到了相似的模式;此处显示的是代表性复制实验。b、一个大约10 kb的基因组空间视图,围绕CRISPR7(淡黄色为leader,黑色为repeat array;紫色星星表示spacer整合位置)。c、CRISPR7数组的更近视图。d、插图显示了CRISPR7、CRISPR2、CRISPR4和CRISPR6的leader和前三个重复序列。

在文章中,研究人员利用微球菌核酸酶保护实验和高通量测序分析了P. furiosus的基因组,主要获得如下结论: 1. CRISPR leader序列区域存在明显的DNA保护峰(图1B-D),提示这些区域可能存在特异性的蛋白-DNA相互作用。2. 保护峰主要由60bp读段组成(图1B),与预测的组蛋白四聚体保护DNA片段大小一致。3. 保护峰位置与CRISPR的表达调控区(promoter等)以及首个repeat序列一致(图1D),提示与CRISPR表达和适应性相关。结果表明CRISPR leader区域存在特异性的组蛋白保护作用。这种保护作用提示组蛋白可能参与CRISPR的间隔序列适应性获得过程

图2:组蛋白的DNA结合

a、Methanothermus fervidus(PDB 5T5K)的DNA结合组蛋白晶体结构41。b、总体上,P. furiosus 中的MNase保护DNA片段在其长度上具有非随机的AT和GC二核苷酸分布,呈现出类似真核生物和其他古菌中组蛋白的10 bp周期性(y轴为特定二核苷酸的相对频率,1.0表示100%)。c、全局AT和GC二核苷酸周期性趋势也在CRISPR leader的60 bp保护峰中观察到。对每个样本进行了三次复制实验的测序;所有样本都观察到了类似的模式。

进一步分析了P. furiosus基因组中MNase保护DNA片段的全局特征,主要得出以下结果:

1. 保护DNA片段呈现出10bp周期性的AT和GC二核苷酸分布规律(图2A),这是组蛋白结合DNA的特征。

2. CRISPR leader区域保护峰的序列也呈现这种周期性规律(图2B),支持这些区域是组蛋白所保护。

3. 预测组蛋白四聚体可引起DNA明显弯曲(图2C)。

综上,图2通过序列分析表明MNase保护DNA片段具有组蛋白的特征,特别是CRISPR leader区域。这进一步支持组蛋白与CRISPR leader区域的结合,并提出组蛋白可能通过影响该区域DNA构象而影响CRISPR的适应性。

图3:组蛋白基因缺失影响体内领导者相邻重复区的间隔片段整合。

a、基于PCR的体内适应性测定的示意图,用于检测新间隔片段在领导者相邻重复区的整合。PCR引物的相对位置由箭头标记。b、来自a中所示测定的PCR产物的凝胶图像。此处使用的菌株仅包含I-B型效应器复合物。在标示的情况下,菌株被转化为共轭质粒pT33.3以增强适应性。*,未扩展的数组;],扩展的数组。该测定使用了七个CRISPR数组的引物,以评估表型的一致性(这里显示了CR7、CR4、CR5和CR6)。c、像b中一样,使用ImageJ定量测量了所有PCR带的强度。确定了扩展产品与未扩展产品的比例,以及数组中新间隔片段的平均数,根据相对带强度计算而得。∆,间隔整合基因被删除(∆cas1,∆cas2,∆cas4-1,∆cas4-2)。d、用于扩增领导者相邻重复区下游(标记为间隔1-3或3-6)的引物,用于检测异位(即,内部到数组)间隔片段的整合。实验进行了五次(CR5和CR7)或两次(CR4和CR6),结果一致;此处显示了代表性的凝胶图和定量结果。

随后通过敲除组蛋白基因,研究了组蛋白对P. furiosus CRISPR间隔序列获取的影响,主要结果为:

1. 敲除组蛋白A或B基因后,新序列的获取频率和数量均显著下降(图3B,C)。

2. 不同CRISPR位点表现一致的结果(图3B),说明是全局效应。

3. 组蛋白对适应性的影响独立于其表达量的变化。

4. 双敲除不可行,说明至少需要一种组蛋白(图3B)。

结果直接证明了组蛋白对CRISPR间隔序列获取的推动作用。与前期的体外和保护作用实验结果一致。验证了组蛋白是适应性过程的重要宿主因子。

综上,实验明确证明了组蛋白对CRISPR适应性取得的推动作用,验证了前期结果,也突出了组蛋白在该过程中作为宿主因子的关键作用。

图4:细菌和古菌系统中DNA结合蛋白参与间隔片段整合的假设模型。

a、c、根据最近的结构和功能数据,显示了组蛋白(a)和IHF(c)如何与CRISPR领导者结合并引导整合到相邻重复区的一般模型。b、M. fervidus PDB 5T5K中的histone B晶体结构,参考文献65。d、E. coli PDB 1OWG中的IHF晶体结构,参考文献68。e、整合反应的组成部分:显示LR和L1组蛋白结合位点(黄色)相对于启动子元素(BRE和TATA分别为紫色和红色),以及CRISPR重复序列(蓝色)和领导者-重复交界处的间隔整合位点的DNA结构;60 bp的DNA上结合的组蛋白四聚体(二聚体以橙色和绿色标记);带有预间隔片段的Cas1-Cas2整合复合物(紫色)。f、组蛋白四聚体结合到L1(左)或LR(右),在CRISPR领导者序列中引起强烈弯曲。g、组蛋白四聚体同时结合到L1和LR,并且Cas1-Cas2结合于领导者-重复间隔整合位点。

文中最后进行了模型拟合,将组蛋白在CRISPR适应性中的作用机制与已知的IHF进行了比较:

1. 组蛋白和IHF都能使DNA发生弯曲从而影响适应性。

2. IHF使上游motif接近Cas1-2实现定位(图4A),模型预计组蛋白可通过类似机制作用(图4B)。

3. 组蛋白四聚体与DNA的结合(图4C)可导致弯曲,弯曲可能促进磷酸基团暴露和核酸酶攻击。

4. 组蛋白与IHF的作用机制类似:都依赖结合引起DNA构象变化。

综上,图4基于结果提出了组蛋白与IHF作用机制类似的模型,认为都依赖DNA结合和构象变化来介导适应性的定向性,为研究组蛋白的具体分子机制提供了框架。该模型还支持CRISPR系统与宿主基因组的共同进化。

总结一下全文,研究团队通过一系列实验和分析,阐明了组蛋白在调节CRISPR间隔获取过程中的机制。具体而言,组蛋白通过调节DNA的可及性和结构影响了整个过程。研究揭示了组蛋白可能通过改变染色质的紧密程度,促进CRISPR-Cas系统将新的间隔序列整合到基因组中,增强微生物对外源DNA的抵御能力。此外,组蛋白还在引导特定外源DNA片段整合为新的spacer时发挥了关键作用。这表明,组蛋白可能协助微生物选择特定外源DNA,并将其有序整合到CRISPR序列,从而提高免疫应答的特异性。

该研究的重要性在于揭示了组蛋白在调控CRISPR间隔获取过程中的关键角色。尽管CRISPR-Cas系统在基因编辑和基因组工程等领域得到广泛应用,但其在微生物中的底层机制尚不完全清楚。这项研究为我们提供了更深入的认识,揭示了古菌中组蛋白如何通过影响DNA结构和可及性来调控免疫系统的效率。

重点

科生景肽作为唯一可合成全长组蛋白和修饰组蛋白的国产厂家,既可以通过化学合成,也可以通过生物表达为客户定制组蛋白产品,同时可完成难度较大的定制修饰,也可提供特殊标记和额外生物素标记,并在出厂时提供可依赖的质控报告。